2023年6月7-8日，瑞沃德特邀達(dá)普生物產(chǎn)品經(jīng)理潘鑫和達(dá)普生物、高級(jí)科學(xué)家肖之夏做客直播間，以“單細(xì)胞測(cè)序:從樣本制備到數(shù)據(jù)挖掘的全流程探討”為主題進(jìn)行精彩分享，在線與大家一起探討單細(xì)胞測(cè)序的奧秘！

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6月7日，達(dá)普生物產(chǎn)品經(jīng)理潘鑫老師，圍繞“從測(cè)序演變探討單細(xì)胞測(cè)序樣本制備與建庫(kù)解決方案”主題進(jìn)行分享，從測(cè)序發(fā)展概述、單細(xì)胞測(cè)序到樣本制備及建庫(kù)重點(diǎn)難點(diǎn)解決進(jìn)行全面講解。

其中，潘鑫老師為大家分享“達(dá)普生物Galaxy系統(tǒng)與瑞沃德單細(xì)胞懸液制備儀無(wú)縫連接”案例，再次強(qiáng)調(diào)瑞沃德與達(dá)普生物雙方強(qiáng)強(qiáng)聯(lián)合，攜手推進(jìn)單細(xì)胞測(cè)序領(lǐng)域發(fā)展的決心。

6月8日，達(dá)普生物、高級(jí)科學(xué)家肖之夏老師為大家分享“單細(xì)胞測(cè)序生信分析及數(shù)據(jù)挖掘”的主題內(nèi)容，詳解生信分析概要、生信報(bào)告解讀、生信數(shù)據(jù)挖掘及案例展示以及如何搭建一個(gè)好的生信平臺(tái)。

其中，肖之夏老師在線仔細(xì)解讀“Scaling of scRNA-seq experiments”“scRNA-seq Workflow & Application”“Reads Quality & Mapping Statistics”等等單細(xì)胞技術(shù)的核心要點(diǎn)及步驟。

答疑精選，問(wèn)題詳解

在直播答疑互動(dòng)環(huán)節(jié)，兩場(chǎng)直播在微信視頻號(hào)、嗶哩嗶哩等平臺(tái)收到很多在線觀眾提問(wèn)，現(xiàn)將兩場(chǎng)直播聊天區(qū)的問(wèn)題，精選26個(gè)來(lái)詳細(xì)解答。

聊天區(qū)部分問(wèn)題詳解

6月7日樣本制備

1. 請(qǐng)問(wèn)老師微流控芯片最多可以同時(shí)處理多少個(gè)樣本呢？

答：達(dá)普的Galaxy單細(xì)胞建庫(kù)系統(tǒng)，每張芯片有可以同時(shí)處理4個(gè)樣本的，也有可以同時(shí)處理8個(gè)樣本的，且芯片上的每個(gè)樣本都是獨(dú)立運(yùn)行，單次可處理1個(gè)樣本，不影響芯片下次使用。

2. 請(qǐng)問(wèn)單細(xì)胞測(cè)序?qū)颖居心男┮笱剑?/p>

答：?jiǎn)渭?xì)胞測(cè)序要求盡量采用新鮮的組織樣本或血液樣本進(jìn)行單細(xì)胞懸液制備，單細(xì)胞懸液制備后要求細(xì)胞活性大于85%， 團(tuán)塊率小于5%，細(xì)胞濃度500-1200cell/μL，非細(xì)胞雜質(zhì)占比小于30%。

3. 雙胞率多少？如果會(huì)的話后續(xù)結(jié)果有影響嗎？

答：通過(guò)人鼠混合細(xì)胞進(jìn)行雙包率測(cè)序，結(jié)果顯示Galaxy 平臺(tái)的雙包率為1.1%/3000個(gè)，后期數(shù)據(jù)分析的時(shí)候可以過(guò)濾掉。

4. 利用消化酶解離細(xì)胞的時(shí)候，會(huì)不會(huì)影響細(xì)胞的表面抗原影響后續(xù)流式分選？

答：在保證細(xì)胞活性能滿(mǎn)足建庫(kù)要求的前提下，對(duì)細(xì)胞表面抗原影響較小，酶解是比較經(jīng)典的組織解離方式，一般流式分選前的細(xì)胞懸液制備也都是通過(guò)這種方式實(shí)現(xiàn)，絕大部分樣本效果還是比較好。

5. 神經(jīng)元樣本怎么做單細(xì)胞測(cè)序？

答：條件允許情況下，應(yīng)將組織樣品充分灌注后進(jìn)行解離。神經(jīng)元樣品制備細(xì)胞核懸液操作相對(duì)簡(jiǎn)單，且雜質(zhì)較少，顆粒參數(shù)更適合單細(xì)胞平臺(tái)上機(jī)。如果能夠制備出滿(mǎn)足平臺(tái)上機(jī)要求的單細(xì)胞懸液，也可以使用單細(xì)胞懸液上機(jī)，可嘗試使用瑞沃德腦組織解離試劑盒。

具體的操作方法我們也有各地域?qū)I(yè)的技術(shù)支持同事根據(jù)不同樣本類(lèi)型來(lái)提供給您一些處理意見(jiàn)。

6. 老師這里講的都是腫瘤相關(guān)的，發(fā)育相關(guān)的研究單細(xì)胞測(cè)序怎么做?。?/p>

答：根據(jù)研究需求，取不同發(fā)育階段組織樣本進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序， 之后構(gòu)建細(xì)胞圖譜，鑒定細(xì)胞類(lèi)群，找到跟發(fā)育相關(guān)的生物標(biāo)志物，通過(guò)擬時(shí)性分析細(xì)胞的發(fā)育軌跡等，分析基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控等，以揭示細(xì)胞發(fā)育的深層機(jī)制等。

7. 你好，間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序的話怎么處理樣本呢？

答：如果您只想做單純的間充質(zhì)干細(xì)胞測(cè)序的話，在制備組織單細(xì)胞懸液后，先需要通過(guò)流式或磁珠分選的方式富集間充質(zhì)干細(xì)胞，之后再按常規(guī)樣本進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建，測(cè)序及數(shù)據(jù)分析即可。

8. 帶熒光細(xì)胞分選要注意什么？

答：細(xì)胞熒光對(duì)單細(xì)胞測(cè)序的捕獲和建庫(kù)過(guò)程沒(méi)有影響，可正常進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。

9. 外周血樣本如何儲(chǔ)存？

答：準(zhǔn)備進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序的外周血樣本，需要先分離PBMC之后再收集PBMC加入凍存液進(jìn)行梯度凍存。

10. 請(qǐng)問(wèn)，手術(shù)組織標(biāo)本，放RNA-later，凍-80，可以用來(lái)單細(xì)胞測(cè)序嗎？

答：凍存和固定后的細(xì)胞不建議進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序，加了RNA-later，組織細(xì)胞活性會(huì)受損，這個(gè)試劑主要是固定RNA，方便后面RNA提取，而單細(xì)胞測(cè)序?qū)?xì)胞活性有比較高的要求，一般來(lái)說(shuō)如果條件允許，盡量別凍存后復(fù)蘇做單細(xì)胞，之前做過(guò)老師凍存的樣本，發(fā)現(xiàn)中位基因數(shù)會(huì)低，以及細(xì)胞類(lèi)群相比于新鮮的會(huì)有所改變。

11. 請(qǐng)問(wèn)可不可以做細(xì)胞核單細(xì)胞測(cè)序呢？

答：細(xì)胞核的樣本的單細(xì)胞測(cè)序也是可以兼容的，我們之前嘗試過(guò)人鼠細(xì)胞系混合樣本提核，效果還不錯(cuò)。

12. 老師您好，不同測(cè)序平臺(tái)有什么區(qū)別嗎？我們?cè)撊绾芜x擇？

答：對(duì)于Galaxy 單細(xì)胞建庫(kù)系統(tǒng)構(gòu)建的文庫(kù)，在不同測(cè)序平臺(tái)上的主要區(qū)別是價(jià)格不一樣， 所以怎樣選擇主要是看您對(duì)測(cè)序價(jià)格的考慮；Galaxy構(gòu)建的文庫(kù)在不同測(cè)序獲得數(shù)據(jù)是高度一致的。

而對(duì)于一些其他平臺(tái)構(gòu)建的單細(xì)胞測(cè)序文庫(kù)在不同平臺(tái)上測(cè)序除了價(jià)格上的差異，另外就不同測(cè)序平臺(tái)測(cè)出的基因中位數(shù)可能會(huì)有20%左右的差異， 這時(shí)選擇就需要綜合數(shù)據(jù)質(zhì)量和價(jià)格雙因素綜合考慮了。

13. 請(qǐng)問(wèn)老師有推薦的實(shí)驗(yàn)工具或者軟件嗎？ 

答：?jiǎn)渭?xì)胞測(cè)序的整個(gè)流程包括包括樣本解離，細(xì)胞懸液質(zhì)檢，文庫(kù)構(gòu)建與質(zhì)檢，測(cè)序及數(shù)據(jù)分析，在組織樣本解離與懸液質(zhì)檢這部分，可以通過(guò)手動(dòng)酶解方式，也可以通過(guò)酶解+自動(dòng)解離方式，瑞沃德有配套單細(xì)胞懸液酶解試劑盒、全自動(dòng)單細(xì)胞懸液制備儀、細(xì)胞計(jì)數(shù)儀供大家完成單細(xì)胞懸液及細(xì)胞質(zhì)檢部分的工作，在單細(xì)胞建庫(kù)這部分，達(dá)普生物有Galaxy 單細(xì)胞建庫(kù)系統(tǒng)及配套的3’轉(zhuǎn)錄組試劑供大家適用，并且有配套的生信分析軟件StarScope幫助大家完成從原始數(shù)據(jù)到生信報(bào)告的分析，導(dǎo)出的表達(dá)矩陣可兼容第三方軟件下游的分析軟件我們推薦使用， 測(cè)序可以兼容主流的測(cè)序平臺(tái)如Novaseq vs T7等。

6月8日 生信分析問(wèn)題解答

1. 老師您好，有好用的工具或軟件推薦嗎？

答：對(duì)于生信數(shù)據(jù)部分，原始數(shù)據(jù)分析可以使用達(dá)普自主研發(fā)的StarScope軟件進(jìn)行分析，獲得表達(dá)矩陣后，可以兼容第三方的軟件，下游的分析軟件我們推薦使用：

seurat（網(wǎng)址：https://satijalab.org/seurat/articles/install.html）

scanpy（網(wǎng)址：https://scanpy.readthedocs.io/en/latest/）

scater（網(wǎng)址：https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/scater.html）

如以人PBMCs為例，細(xì)胞鑒定可以借助CellMarker2.0軟件 ；數(shù)據(jù)的整合分析可借助Seurat5 工具；

2. 請(qǐng)問(wèn)老師有哪些單細(xì)胞數(shù)據(jù)庫(kù)是比較好用的呢？

答：目前比較好用的數(shù)據(jù)庫(kù)有：Panglaodb，Human Protein Atlas等。

3. 如何判斷數(shù)據(jù)的質(zhì)量是否ok？有固定的某幾個(gè)數(shù)據(jù)綜合來(lái)看嗎？或者數(shù)據(jù)的值高于某個(gè)固定數(shù)值，就能表明數(shù)據(jù)的質(zhì)量是比較好的？

答：判斷數(shù)據(jù)質(zhì)量最直觀首先看測(cè)序的Q30是否大于90%， 其次看捕獲的細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞捕獲大于45%以上是比較正常，再就基因中位數(shù)，正?；蛑形淮笥?000比較正常，reads Mapping到基因組上的信息是否大于90%，再深入一點(diǎn)就看線粒體基因污染，被檢測(cè)到的線粒體基因百分?jǐn)?shù)，一般細(xì)胞有>20%線粒體基因表達(dá)的話，被認(rèn)為是死細(xì)胞。

Cell barcode圖的拐點(diǎn)是否明顯，不明顯可能就是細(xì)胞碎片比較多。

4. 請(qǐng)問(wèn)細(xì)胞通訊分析的計(jì)算方法中，一般是分析系統(tǒng)中根據(jù)不同細(xì)胞默認(rèn)的一個(gè)數(shù)值？還是需要根據(jù)經(jīng)驗(yàn)多次嘗試？

答：Cell-cell communication的分析中較為常用的軟件是cellphoneDB。其input包括normalized過(guò)的表達(dá)矩陣，每個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞類(lèi)型信息（需要預(yù)先進(jìn)行細(xì)胞類(lèi)型注釋?zhuān)?，和cellphoneDB的數(shù)據(jù)庫(kù)文件。一般使用默認(rèn)的參數(shù)就可以適用于大多數(shù)的研究了。

5. 分群的時(shí)候T細(xì)胞的兩個(gè)cluster分的很遠(yuǎn)，沒(méi)在一起怎么辦？

答：如果是多樣本整合的結(jié)果可以先確認(rèn)下是否是批次效應(yīng)等原因?qū)е碌?。T 細(xì)胞本身包括兩大類(lèi)群CD4和CD8，在正常數(shù)據(jù)中就會(huì)存在兩個(gè)不同的分群。

另外在病人或者是接受了處理的數(shù)據(jù)中，很可能還會(huì)已經(jīng)有了免疫細(xì)胞的響應(yīng)，在多樣本整合的結(jié)果中還有可能出現(xiàn)多個(gè)不同響應(yīng)的細(xì)胞群體，所以是有可能出現(xiàn)不同存在于不同的cluster的。另外UMAP和TSNE中的距離是經(jīng)過(guò)特定的換算，并不能代表實(shí)際的細(xì)胞距離。

6. 老師好，單細(xì)胞過(guò)濾的時(shí)候，有關(guān)紅細(xì)胞基因是否要過(guò)濾？

答：一般單細(xì)胞懸液制備的過(guò)程中，都會(huì)加一個(gè)破紅的過(guò)程以去除紅細(xì)胞，正常情況都不做紅細(xì)胞過(guò)濾處理。

7. 老師好，想請(qǐng)問(wèn)下，要拿到像您show的那么漂亮的數(shù)據(jù)，對(duì)細(xì)胞的要求是怎樣的呀？

答：對(duì)細(xì)胞的要求是，首先無(wú)論組織樣本還是血液樣本，盡量采用新鮮樣本， 細(xì)胞懸液活性85%以上，團(tuán)塊率小于5%， 細(xì)胞濃度不低于500-1200cell/μL。

8. 想問(wèn)一下老師，影響測(cè)序深度的因素有哪些呀？

答：影響測(cè)序深度主要是組織類(lèi)型和狀態(tài)，細(xì)胞捕獲數(shù)和測(cè)序的數(shù)據(jù)量，測(cè)序數(shù)據(jù)量越高，測(cè)序質(zhì)量好，測(cè)序深度就越高。

9. 孔板法和微流控各自的優(yōu)缺點(diǎn)是什么？應(yīng)該怎么選擇呢？

答：孔板法的有點(diǎn)是對(duì)細(xì)胞活性要求相對(duì)低一些，缺點(diǎn)是單次運(yùn)行樣本數(shù)量少，一般1-2個(gè)樣本，且每張芯片上微孔數(shù)有限，細(xì)胞上樣量相對(duì)較低，獲得細(xì)胞較少；

微流控的優(yōu)點(diǎn)是單次可同時(shí)處理多個(gè)樣本，且每個(gè)樣本可上數(shù)萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞捕獲率也比較高，50%以上，需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需求及樣本情況進(jìn)行選擇，希望獲得更多細(xì)胞樣本的信息可以選擇微流控平臺(tái)；對(duì)于樣本量少，細(xì)胞活性也不好的樣本，可以試試微孔板法，應(yīng)該也能獲得一部分細(xì)胞的信息。   

10. 請(qǐng)問(wèn)老師測(cè)序的數(shù)據(jù)量和捕獲細(xì)胞數(shù)對(duì)數(shù)據(jù)的結(jié)果影響大嗎？

答：不同的測(cè)序深度，在達(dá)到飽和之前，獲得基因中位數(shù)據(jù)和細(xì)胞數(shù)量相差比較大，基因中位數(shù)不同的組織樣本的標(biāo)準(zhǔn)差別較大，一般應(yīng)該大于1000；捕獲的細(xì)胞數(shù)量對(duì)不同研究需求有一定的影響，如一些稀有細(xì)胞群的鑒定可能會(huì)受影響。

11. 請(qǐng)問(wèn)老師影響捕獲細(xì)胞數(shù)量的因素有哪些呀？

答：影響細(xì)胞捕獲的因素包括：細(xì)胞懸液的質(zhì)量（活性，細(xì)胞碎片、團(tuán)塊率），投入的細(xì)胞數(shù)量及單細(xì)胞包裹是否成功，反轉(zhuǎn)錄建庫(kù)試劑盒性能等都會(huì)影捕獲的細(xì)胞數(shù)量。

12. 3'和5'的基因表達(dá)文庫(kù)有什么不同嗎？

答：3'和5'的基因表達(dá)文庫(kù)的不同一個(gè)是獲得3'端基因序列，一個(gè)是獲得5'端基因序列，5'端主要用于免疫組庫(kù)的分析

13. 請(qǐng)問(wèn)能專(zhuān)門(mén)做粒細(xì)胞的單細(xì)胞測(cè)序嗎？

答：由于粒細(xì)胞離體后仍然非?；钴S，容易在獲取過(guò)程或?qū)嶒?yàn)過(guò)程中破碎、死亡，有些研究表明其會(huì)向背景中釋放可剪切游離核酸片段的物質(zhì)，影響測(cè)序質(zhì)量，以上因素導(dǎo)致含粒細(xì)胞比例較大的樣本很難得到有效的單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)，一些多組學(xué)實(shí)驗(yàn)中則需要設(shè)法去除中性粒細(xì)胞。

截至目前，針對(duì)粒細(xì)胞的高通量單細(xì)胞測(cè)序尚無(wú)高質(zhì)量的數(shù)據(jù)結(jié)果。

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